主持人：非常感谢。下一步是荷兰乌特勒支大学兽医学院PeterJMRottier教授，发表的主题为：“猪流行性腹泻病*感染过程中靶细胞受体”PeterJMRottier教授是著名动物冠状病*学家。
PeterJMRottier：
现在开始，首先感谢一下我们的组织方邀请我来参加这个会议，我是第一次有幸参加这样一个公共卫生的论坛，尤其感谢我的朋友李震博士作为今天的主办方之一，对于我来说李震博士是老熟人了。在我的实验室是高级访问学者。我今天的话题对于猪流行性腹泻病*过程中的靶细胞受体，我们也希望收集一些信息，从根本学的角度来讲，从基础学科的研究来讲，希望有效从我们的名义以及病*保护的机制进行一些调整。
对于这个PECD病*，我们知道它是一种冠状病*是发生多种病*当中，我们可以看到与此同时它也会有一些人的冠状病*，比如最左侧人的冠状病*。这是几年之前爆发的SARS以及MERS的病*，也是两年之前开始，这是非常重要的病*，包括猫科还有犬科的，还有鸡传染性支气管炎，也是在养鸡场造成了大范围的经济损失。还有猪流行性病学简称PEDV，PEDV感染猪并且在肠道进行复制，在小肠绒毛当中进行复制。我知道大家了解这个病*已经很久了，之前可能有问题，但是问题不是太严重，但是它的传染性是很强，尤其是从仔猪死亡率来讲还是比较高，小于三周仔猪死亡率很高。
这是冠状病*一个图片，大家在图片当中可以看到它的结构如图所示，病*入侵的时候，这个过程本身来讲，它也会有很多的因子，或者与细胞相关的一些因素，包括细胞内吞，从细胞内吞开始，可以看到病*逐步进入细胞，它也会通过病*膜和数祖细胞膜进行融合。最终可以和壳异核蛋白，以及重组的方式，冠状病*可以这样非常简单的进行基因组基因物质的交换，这样很容易进行传播。我们再观察一下这边纤突蛋白，纤突蛋白在整个细胞入侵时发挥着非常重要的角色，它会和细胞组建进行互动。除此之外我们可以看到病*核所谓细胞膜会有一个融合的过程，像纤突这个蛋白来讲是一个比较大的蛋白，但是它会有膨化和异型，它也是一个决定因素。我们可以看到这样的病*，它是通过不同的方式进行侵入。我们分为S1和S2两个区域，这两个区域S1涉及到受体融合，S2是膜融合。这边它的一些蛋白，它如何是可以从病*蛋白的复制，并且吸附宿主的蛋白。
这是一个蛋白，今年早期在《自然杂志》发表的文章，这个文章是有关冠状病*，在很多年不断尝试之后，我们最终看到它的完整的结构，而且也是和（英）的研究，巴斯特研究中心以及西雅图华盛顿研究中心进行共同的合作。这是非常重要的，因为它给我们提供了非常多的信息，待会儿大家可以一一看到。当我们的结构放在这样的病*之下，我们看到病*纤突是这样的结构，我们也是进行进一步的解读。大家看到这样的结构，大家看到在这儿这是它结构表面，大家可以看到纤突含三个分子，蓝色、*色和粉色，大家可以看到有三聚物，这三聚物质非常紧密结合在一起。这三个在分体角度来讲，互相紧密结合在一起。
可以看到在细胞侵入过程当中和融合过程当中，他可以分解为不同的分解物，进行不同物质的交换，进行融合。这是单体物，在图片可以看到，原先是从三体物出来的。这个给大家展示出有两个DomainA和B，这些Domain是非常突出的结构，可以我们看到他们之间的一些差别。在这儿我们看一个部分，就是它的受体结合这一部分，受体结合这部分大家可以看到Domain都在这儿，所有DomainA和B，都可以结合病*的受体，而DomainA也是主要的结合部分，像冠状病*来讲，它们是直接找到他们自己直接在DomainB的受体。
冠状病*受体我们一直在研究，我们现在要了解不同的表现，有些病*已经得到了确认。我需要指出的是，这样一些病*它属有不同的类别，有β、α、γ的冠状病*，也会感染到猪。对于β冠状病*来讲包含MHV、还有SRAS病*。PEDV包括猪呼吸道冠状病*，还有猪流行性腹泻病*，这些病*都在配体和其他物体上进行结合的。通常情况下它们会导致呼吸道和肠道的疾病，对于PEDV我们知道，它是一个肠道的冠状病*，它的受体已经被确定，叫做我们的乙酰神经氨酸，它是一个多糖受体，同时也有像糖受体和冠状受体两种类型。对于大部分冠状病*来讲，我们主要用的是唾液酸。这个部分我既要提一下蛋白质受体也要提一下多糖受体。我们有很多报告在过去实践都中都会生成，我这里给大家举几个报告的例子。
对于这样层面的PEDV受体的研究，我们开始提出这样的质疑。这些所谓的说法是否属实？我们自我扪心自问一下，是否真的通过蛋白酶是否真的是受体？我们需要展开研究，并且需要观察，并且在观察基础之上，也尝试着观察我们的结果，是否和我们预想的结果类似，当然这是非常有趣的例子，当中我们可以看到很多不同的例子。我们必须要加强研究，ABM是否是它的主要真正受体，我们首先做了这样一项研究。我们发现了出氨基氨酶，氨基肽酶的表达是造成猪流感性的主要原因。我们经过荧光染色可以看到具体的情况，这里可以看到APN的染色，之后我们发现这些细胞受到感染之后，一些*株其实是不一样的，我们也是把TGEV在这里作为一个对照组，因为TGEV它是使用AGM作为受体，这点是毫无疑问。所以说对PEDV病*，MDCK细胞是不能够接受这样的受体，我们发现我们表达APN的时候他们对于TGEV并不会产生敏感性，但是对于PEDV是这样的，这也是证实发现确实有发挥的效益。
同时我们也是经常会使用固定的一些方法去进行细胞的分离，通过这种方法我们可以更好清除病*，但是它们并不能对TGEV感染。这个现象告诉我们TGEV的受体和PEDV是不一样的。我们也做了另外一项研究，我们把TGEVS1和PDEVS1进行重组，会使用生物技术进行激活，通过这项结论得出以下结论。除此之外也会对细胞进行染色，我们把MDCK2以及TN细胞进行染色，我们发现TGEV可以识别出染色细胞，但是对于PEDV并没有展现出活体。
我们使用溶解的PEDV作为一项主要的蛋白酶，我们会把它作为工具进行实验，我们把它结合到TGEV和PEDV进行两种比对，我们发现可溶解的APN都可以产生非常明确的反应以及现象。哪怕是在被感染和没有被感染的动物身上，我们都可以发现明显的对照以及对比。但是对于PEDV的话，我们发现没有什么样的变化，这个也从另外一个角度证实了TGEV的PEDV不同之处。我们也进行研究是否会进行感染，我们使用是这套方法进行检查，我们使用了可溶解的APN，然后发现并没有检测出病*。S1蛋白也这样的作用可以组正感染，这也是证实了S1蛋白的重要性。作为TGEVS1蛋白可以进行多样性重组，这样的话，细胞有更强的活力。这项实验证实了如何通过S1蛋白进行组证。
下面我们做了把S1蛋白进行消除，也消除了APN的表达，通过这种方式知道TGEV不是PEDV的感染，与上述结论恰恰相反，通过这两种方法我们可以更好调除细胞当中蛋白，这样的话避免病*进一步感染，并且可以阻止细胞株内部的传递。按照我们的分析，APN在这个细胞当中已经被清除，在这张图下面一点，通过消除APN表达，我们可以利用ST细胞更好抑制TGEV而不是PEDV的感染，这也是我们这项结论得出的结论，所以说APN有没有并不是太大的作用。这是按照之前的研究，按照之前的研究证实了恰恰相反的结论。我们在另外一个场景下，做了另外一个实验。
下面简单做一个简单APN并不是PEDV的受体，下面列出了之前的实验依据就不过多赘述细节，其中最重要的一点，就是我们PAPN可溶解性对于TGEV的影响而并不是PEDV，这个结果对于我们来讲是非常惊人的。我们也发布在了《病*学杂志》上，我们哪怕获得了这样的研究结果，自己都感觉有所疑惑，而且不确定如何发布这项研究。
因为你很难会发布这种与其他研究观点非常迥异的研究，但是我们得到了另外一个来自日本团队研究，他也是得出了类似的结果，APN并不是受体，这与我们的结论不谋而合，这也是验证了我们双方的研究重要性。我们发现氨肽酶都是非常重要的，在我们进行APN表达的时候，我们探寻了它在受体的不同之处，对于CV的pAPN，通过细胞它的敏感度可以大幅度上升。简单总结一下这里通过APN对于感染距的增强，我们可以看到对于PEDV的影响，APN的表达确实可以造成APDV的增加，这一结论很有可能是为什么其他的研究结论感觉非常混淆的原因。这项研究让我们来讲，其实获得了很大的进步。我们可以更好分享，为什么pAPN会发挥这样的作用。
接下来按照我们的介绍，APAN很有可能起到了非常重要的作用，这里还有月亮状的酶，因为酶含量确实很丰富，同时蛋白很重要的方式是会生成酶，这点不得而知会进行后续的研究。其实讲到现在我们也没有一个具体的答案，我们可以唯一缺点的一点，PEDV对比DGV它其实是非常多样的，它可以影响多种类型的细胞，不仅仅是动物、人，同时还会影响本身已经损害的细胞，所以说它的感染媒介是非常广。我觉得受体相对来讲是一个蛋白，我们必须要做更多的食盐才可以发现它的受体究竟是什么。
最后一部分，我想针对唾液酸发表一些见解，唾液酸可以是PVE细胞入侵的时候一个联合受体，这也是S1蛋白一个角色和作用。我们再来看一下这个示意图，这是HCOV的情况，这份论文目前为止也已经发表在了《自然杂志》上，再看一下第二个冠状病*的结构，NL63也是一个有趣的论点，因为它和PEDV非常相似，这里的结构尽管看起来很相似，但是看一下细节还是存在很大的不同之处。特别是再看一下俯视图，我们发现它完全不同，这里我们还是可以发现它们其实是有两个维度，两个领域，我们可以在这里看到这个领域，可以从不同的角度分析冠状病*的组成，当然还有国外的一些域，这里并没有标出来。我们在打造这样的架构的时候，必须会有一个额外的域才可以，这里是一个NL63以及S1的整体结构，同时你可以看一下这个领域的具体情况。再下面这个域是NL63蛋白的领域，再看一下其他的α蛋白，比如说在不同的域之间，在这两个冠状病*之间，它有着可能很复杂的结构。除此之外，这之间存在着很大的差别，在人源性以及动物源性之间存在很大的差别，人源相对来说基因序列更加接近零。但是我们如果再仔细思考一下，他们其实已经是得到了非常好的检查，并且已经有了充分的了解。这里有一个领域是*色，另外一个领域上我们可以调整整个域的结构，这里是有两个域的，所以说这中间并不见得有规律可寻。作为PGV，其实在这一领域，是非常重要的一个研究，我们从来不会作为一个问题来看待。因为随着新的变种出现，它可能会对整个病*带来很大的病种，我们并没有命名为一个机制。它相当于成为一个准入病*，作为（英）它也与感染非常相关。除此之外它与FECV也是相关的。同时也与RAA病*相关，它也会产生场内感染，基本上都与RA9这个病*产生的。
下面让我们再看一下另外一项研究的结果，我们分析了唾液酸，对于PEDV有什么效果，我们发现它产生了极大地增强，并且会产生变异。就像酸奶的培养一样，我们发现特别是对于PEDV的培养剂，虽然唾液酸的移除，PEDV的效果会得到极大地的增强，这也是我们最近做的一项研究，获得了中国团队的支持。当然我们还有另外一个菌株的变异，也是去年发现的，的确病*的变异通常对于唾液酸并不敏感，我们可以发现下属的变化。我们知道流感病*它可以生成唾液酸，进行其他的灭活。我们会打造更多的菌株，只有通过这种方法，我们才能够获得更加重要的理解。过去检验当中，整个全球的学界，都在希望观察这些不同的菌株，更加深入了解他们的情况。我们有研究员，有医生，还有专家，所有的这些加在一起都可以探寻找到菌株的研究解决方案，它对这些唾液酸还是特别敏感。主要由于零号区域插入缺失，待会儿会给大家进一步展示。我们可以看到通过唾液酸对于菌株进行增强的效果。对于唾液酸的吸附也会对不同的唾液酸有所差异，他们会用病*粒子做血凝实验，大家看到在这种情况下，它是否会出现了所谓的融合或者逐步融合。在第十三号菌株当中，我们可以看到它的结合比较多。对于像IAV的病*也会有不同的情况，对于GDU的病*，你可以看到唾液酸它确实有这样的效应。如果我们对有（英）对它进行处理的话，你就可以得到它的在不同菌株的情况下，唾液酸吸附效果的差异。这里面是IAV流感病*和其他一些病*对照的结果。所以我们刚才是用的是血凝实验，刚刚用的是病*粒子，现在用的是纳米磁株，我们用（英）技术用这样小颗粒，用纳米技术的大小暴露I蛋白，观察它的吸附的效果。这个时候会生成类似于病*一样的颗粒，我们可以把它应用到我们的实验当中，这样可以给我们有额外信息的获取。大家可以看到，这个时候像禽流感的一些对照组，就像我们刚才使用病*粒子的时候，这个并没有显示有这么吸附的效果，这个在纳米磁株的情况下，血凝实验可以获得结果。
我们进一步向下，我们现在已经进入了S1区域，S1区域当中有零和其他的Domain，所以我们这个时候由S1区到Domain0，现在还有GDUS1，SDUS0等等，我们所谓S1、S2、S0进行血凝实验，这个时候观察更多的内容的情况，这些Domain它也是有不同的情况。我们在这里预期的结果就是让它把这个内容拿出来的时候，它会这样的一个结果。我们会进行切合体，比如说GDU，它会和比方说S1区的0进行嵌合，你观察它在迁合情况，有一个有，有一个没有。这个时候也会把红色进行关联，就是对血凝实验进行关联。这个时候对于病*来讲，它也会是我们了解到它是否会对于我们的唾液酸会起到了唾液酸吸附的作用。当然在不同层级的一些0Domain吸附能力会进行对照。PEDV的干扰是通过不同细胞进行介导，还有一些共同的一些受体以及附带的一些因子酶等等，我们知道在（英）细胞侵入的时候，还有其他的酶会扮演非常的重要的作用，PEDV会有一系列的因素进行介导的。（英）会通过蛋白酶的功能增强感染，唾液酸的吸附会强化对于感染的菌株的能力，我们可以马上知道它的结果。而唾液酸的吸附它是通过S区域蛋白域0进行介导，对于Domain0的缺失，以及唾液酸的吸附，通常情况会长趋向性和*性的缺失对于降低是有一定关系的。而且PEDV主受体没有得到受轮，这是我自己的主要的概述，我们所有的都是由中国研究生进行做的，包括李文涛，还有其他工作人员的支持，就说这些多。
主持人：非常感谢，大家对于Peter教授还有什么问题？
TilahunDYilma：一个特定的病*它可能会有两种不同，它的受体也不一样。我的问题是，尤其像（英）的病*，有的时候你可能无判断对于VCCSD以及热带细胞它有什么区别，如果你给到犬类以及牛的话，可能还是同样的疾病，但是这时候可能有所不一样，有时候对于手足口病来讲，不同的受体身上就是不一样了。
PeterJMRottier：我只能做一个个人观点进行评价，因为对于冠状物体来讲它的受体是非常独特的。实际上你非常清晰知道它的分离蛋白的检查，对于APN和受体蛋白，你知道两个非常重要突出位置，在我们研究开始的时候，我们已经研究了它的PEDV的突出部分，它和TGEV来讲是没有同样结构的，所以这个时候我们也会在此结论之上，认为并不是对于TEGV主要受体，并且在这个基础之上，我们进一步开展研究的。
周勇：教授感谢您的精彩的数据我的问题我们知道，大部分的病*进入细胞的时候可能是不同的，当然高通道的病*和低通道的病*，你如果把病*进行更换的话，是否有变化？
PeterJMRottier：我们做过低通道和高通道的病*，我们会在这个区域诱导它的涂片，这个涂片也会改变它吸附的属性。我们发现在这个过程当中，第13菌株来讲，也很多人用菌株，这个菌株在过去当追我们可能用了多次，我们看到很多图片但是尽管如此我们并没有看到它的受体通道有太大的变化。对于出现异质性的情况，回到您的问题对于细胞培养的异质。
观众：另外对于您发现血凝研究的发现。您的结论就是唾液酸的吸附它完全独立性的是吗？是的，我们有没有可能GDU是属于分型A的？13是属于基因分型1？这是基于你的结论得出的，大部分都可以得出基因的数据是吗？
PeterJMRottier：是的，对于这些菌株如何吸附不好或者不与唾液酸结合的话，他们在临区可能会有图片，通过这样的突变他丢失了它可以结合临区受体的能力。它的一些插入缺失的菌株来讲，他们有比较低的致病性，他们是属于遍体，这个主要原因是与唾液酸结合作用减弱导致的，这样的话我们会把相对细胞进行调整，希望出现类似于TGEV还有AVV上面的效果，我们可以在测试过程当中，通过其他的方式，通过这种方式降低错误性。
注：本文内容为现场速记内容，文中标注(英)为人名、地名或专业名词，修正后的报道将在《国外畜牧学——猪与禽》杂志上刊登。
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