KeyLaboratoryofBiodiversityFormationMechanismandComprehensiveUtilizationofQinghai-TibetanPlateauinQinghaiProvince
概述
OVERVIEW
JOURNALOFMEDICINALFOOD(IF=1.)刊载了一篇由佐藤夕子博士(E-mail:skagotamukogawa-u.ac.jp)团队发表的名为EffectofRoyalJellyonMouseIsolatedIleumandGastrointestinalMotility(DOI:10./jmf..:Published26April)的论文。该文章首次在体内实验中评价了RJ对小鼠回肠的运动性的影响，以验证RJ作为温和泻药的应用。前言TNTRODUCTION
蜂王浆(RJ)是一种从工蜂下咽和下颌腺分泌的乳白色物质。孵化后，将成为工蜂的幼虫仅在RJ停留3天，而在此之后，蜂王继续摄取RJ。RJ在亚洲被用作传统药物，在许多国家作为美容产品和补充剂销售，以促进美容和健康。新鲜RJ由水、蛋白质、碳水化合物、脂肪、矿物盐和少量多酚和维生素组成。此外，脂肪酸、蛋白质、腺苷、乙酰胆碱(ACh)、睾酮、孕酮、催乳素和雌二醇等均被报道为RJ中有用的生物活性成分。RJ的这些成分具有许多药理作用，如抗菌、抗肿瘤、抗过敏、抗炎和免疫调节作用。一般来说，女性和老年人容易便秘。便秘是日常生活中常见的问题，尤其是对于饮食习惯不适应、全身疾病和心理并发症的人来说，便秘可以由一些药物作为副作用引起。生活方式的改变，如饮食和运动，可能会缓解便秘。此外，泻药可以改善便秘，但会导致严重的副作用，如腹泻。RJ有时被商业推荐用作温和的泻药；然而，只有少数研究详细研究了这些行为。在一项对人类的研究中，蜜蜂能量的摄入?（麦卢卡蜂蜜产品，含3%RJ，~90毫克RJ，3g/d）连续8周便秘明显减少。相反，给予酶降解RJ(~4g/天)并不能改善便秘。在动物研究中，据报告RJ在离体豚鼠回肠中诱导收缩，这种收缩被乙酰胆碱酯酶和*蕈碱受体阻滞剂抑制。然而，RJ引起的回肠收缩的详细机制和RJ存在的功能因素尚不清楚。因此，在这项研究中，我们使用分离的小鼠回肠样品研究了RJ引起的肠收缩的详细机制。此外，为了研究口服RJ是否能增加回肠运动以改善便秘，我们评估了在正常小鼠和洛哌丁胺治疗的便秘模型小鼠中口服mg/kgRJ是否能增加胃肠道(GI)转运。本研究是首次在体外实验中评价RJ对小鼠回肠运动的影响，以验证RJ作为一种温和泻药的应用。
方法METHOD
1.材料雄性Slc:ICR小鼠(26–41g)，饲养在受控的室温下(22℃–24℃)在实验前，在50%–10%的湿度下，以12/12-h的光照/黑暗周期至少1周。乙酰胆碱酯酶溶解在磷酸钠缓冲液(0.5mgBrij-35/mlmmolNa2HPO4，pH7.5)中，并在-70℃直到使用。其他化学物质都溶解在蒸馏水中，Krebs–Henseleit制备方案(Krebs；.4mMNaCl,4.7mMKCl,2.5mMCaCl2?2H2O,1.2mMKH2PO4,1.2mMMgSO4?7H2O,25.0mMNaHCO3,11.1mM葡萄糖；鼓入95%O2/5%CO2的气体)是为体外实验准备的。
2.离体小鼠回肠收缩反应的测量禁食24h后，在戊巴比妥钠麻醉(65mg/kg，i.p.)下从小鼠体内取出回肠。所有节段(~10mm长)均取自回肠-盲肠连接处上方30mm或以上的位置。将这些片段悬浮在一个10ml的器官浴室中，该室装有浓度为0.5g的乙醚溶液。所有的药物都加到浴缸里，通过传感器(型号T-7)使用记录仪(WR)记录等长张力。使用自发收缩的中点作为基线，从图表中测量收缩力。首先，向浴中加入单剂量的乙酰胆碱(10-6M)，然后平衡30min。在所有测量之间，允许系统稳定总共30min，每10min用新鲜的Krebs溶液进行三次交换。接下来，将RJ(10-8–3×10-3g/mL)或乙酰胆碱(10-9–3×10-4M)累积加入到浴中(反应的第一次测量)。最后，在稳定期后，进行RJ或乙酰胆碱的累积添加(反应的第二次测量)。在某些片段中，在第二次测量中，在有或没有阿托品(3×10-7M)的情况下，RJ(10-8-3×10-3g/mL)或乙酰胆碱(10-10-3×10-5M)被累积加入。在RJ或乙酰胆碱累积给药前，允许用阿托品或赋形剂(蒸馏水)治疗3min。为了研究乙酰胆碱酯酶抑制剂的效果，用*扁豆碱(10-8M)处理其它制剂5min，然后施用RJ(10-5或3×10-5g/mL)或乙酰胆碱(3×10-7M)。在另一部分中，尼古丁(10-8–10-5M)、RJ(10-6–10-3g/mL)或乙酰胆碱(10-6–10-4M)被累积添加到浴中，用于反应的第一次测量。为了研究一氧化氮合酶抑制剂对这些收缩的影响，将L-NAME(10-4M)或载体(蒸馏水)孵育20分钟，然后在第二次测量中累积加入RJ、尼古丁或乙酰胆碱。每种拮抗剂的治疗条件选自一系列初步实验。当收缩达到在反应的第一次测量中获得的最大收缩力时，在第二次测量中获得的每种浓度下的收缩被计算为%。通过收缩药物浓度关系的非线性曲线拟合来分析个体浓度响应曲线，以使用GraphPadPrism?软件(ver)计算负对数EC50和最大响应(Emax)。
3.乙酰胆碱酯酶对RJ或乙酰胆碱诱导的离体小鼠回肠收缩的影响将单剂量的RJ(10-4g/mL)或乙酰胆碱(10-6M)加入到浴中作为对照(反应的第一次测量)。在反应的第二次测量中，RJ或乙酰胆碱与乙酰胆碱酯酶或载体(蒸馏水)在37℃在5min内加入到浴中。器官浴中RJ、乙酰胆碱和乙酰胆碱酯酶的最终浓度分别为10-4μg/ml、10-6μg/ml和30ng/ml。当收缩达到在每个片段的控制反应中获得的收缩力时，在第二次测量中由与乙酰胆碱酯酶或媒介物一起孵育的RJ诱导的收缩高度被计算为%。4.RJ乙酰胆碱浓度的测定如前所述，使用扩增荧光乙酰胆碱检测试剂盒测量RJ乙酰胆碱的浓度。简而言之，将0.03gRJ溶解在1ml蒸馏水中，并与反应溶液在室温下温育30min(25℃)。计算结果为1gRJ中所含的浓度。
5.胃肠道转运评估遵循其他小组以前报告的准则，我们调查了RJ是否影响木炭粉的胃肠道转运。实验开始前，小鼠禁食24h，水可随意使用，灌胃溶于0.25%羧甲基纤维素或赋形剂(0.25%羧甲基纤维素)的洛哌丁胺(10mg/kg)。30min后，口服溶于蒸馏水或赋形剂(蒸馏水)的RJ(mg/kg，口服)。15min后，口服木炭粉(10%木炭/10%阿拉伯树胶)。每种药物以10ml/kg体重的剂量给小鼠服用。木炭粉治疗30min后，在戊巴比妥钠(65mg/kg，静脉注射)麻醉下，通过颈椎脱臼处死小鼠。小心地分离小肠并用Krebs溶液冲洗。木炭粉的胃肠传输是以木炭粉相对于每只小鼠小肠全长的距离百分比来计算的。结果RESULT
1.RJ和乙酰胆碱引起的离体小鼠回肠收缩及阿托品对收缩的影响图1显示了RJ和乙酰胆碱对小鼠回肠功能的影响。RJ(10-8–3×10-3g/mL)和乙酰胆碱(10-9–3×10-4M)以剂量依赖的方式诱导收缩增加。RJ诱发的最大收缩力和乙酰胆碱诱发的最大收缩力之间没有显著差异(表1)。
图1.RJ和乙酰胆碱诱导的离体小鼠回肠剂量依赖性收缩。RJ(10-8–3×10-3g/mL，开放圆)或乙酰胆碱(10-9–3×10-4M，开放三角形)累积加入器官浴。每个点代表平均值±SEM。ACh，乙酰胆碱；RJ，蜂王浆；SEM，平均值的标准误差。
表1.蜂王浆和乙酰胆碱诱导的离体小鼠回肠收缩参数
为了检查*蕈碱受体是否参与RJ诱发的收缩，用非选择性*蕈碱受体拮抗剂阿托品治疗小鼠回肠。通过用3×10-7M阿托品预处理3min，RJ诱发的收缩显著减少，这类似于乙酰胆碱诱发的收缩的结果(图2)。图2.阿托品对RJ和乙酰胆碱引起的离体小鼠回肠收缩的影响。RJ(10-8–3×10-3g/ml)或乙酰胆碱(10-10–3×10-5ml)在有阿托品(3×10-7M，3min)或无阿托品(-7M，3min)的情况下累积加入器官浴中。每个点代表平均值±SEM。星号显示与Emax上未注射阿托品的样品有显著差异，***P.(t检验)。
2.扁豆碱和AChE对离体小鼠回肠RJ和AChE诱导收缩的影响如图3A和3B所示，单剂量RJ(10-5或3×10-5g/ml)和乙酰胆碱(3×10-7M)引起的收缩通过用*扁豆碱(一种乙酰胆碱酯酶抑制剂)预处理5min而增加。在用乙酰胆碱酯酶以30ng/mL的浓度预处理5min后，由RJ(10-4g/ml)或Ach(10-6M)诱发的收缩完全消失(图3C，D)。图3.*扁豆碱或乙酰胆碱酯酶对RJ和乙酰胆碱引起的离体小鼠回肠收缩的影响。在*扁豆碱(10-8M，5min)存在(实心柱)或不存在(空心柱)的情况下，将RJ(10-5或3×10-5g/ml)或乙酰胆碱(3×10-7M)加入器官浴中。RJ(10-4g/mL)或乙酰胆碱(10-6M)与或不与重组小鼠乙酰胆碱酯酶(30ng/mL，5min)一起孵育，然后作用于回肠段。未确定(完全抑制RJ和乙酰胆碱的活性)。数值是平均值±SEM。星号显示与未使用*扁豆碱的样品有显著差异，*P0.05(t检验)。AchE:乙酰胆碱酯酶。3.L-NAME对离体小鼠回肠RJ、ACh或尼古丁诱导收缩的影响据报道，尼古丁受体的激活通过在小鼠结肠和小鼠回肠中产生一氧化氮来诱导松弛。因此，我们测试了尼古丁受体是否与RJ诱发的小鼠回肠收缩有关。用L-NAME(10-4M，20min)一氧化氮合酶抑制剂治疗，在10-5或10-4g/ml时不影响RJ诱发的收缩(图4A，B)。类似地，乙酰胆碱在10-5和10-4M诱导的收缩通过用L-NAME预处理而没有改变(图4C，D)。相比之下，尼古丁在10-6或10-5M时引起的收缩在治疗后显著增加。
图4.L-NAME对离体小鼠回肠RJ(A,B)、ACh(C,D)和尼古丁(E,F)诱导收缩的影响。将RJ(10-5和10-4g/ml)、乙酰胆碱(10-5和10-4M)和尼古丁(10-6和10-5M)在L-NAME存在(实心柱)或不存在(空心柱)的情况下(10-4M，20min)加入器官浴中。数值是平均值±SEM。星号表示与不含L-NAME的样本有显著差异，**P.01(t检验)。L-NAME，NG-硝基-L-精氨酸甲酯。4.RJ乙酰胆碱浓度的测量1gRJ中乙酰胆碱的浓度为–23μg。如表1所示，通过换算成摩尔单位(mol/L:M)，在RJ的-logEC50值时，RJ的乙酰胆碱浓度为1.1-7M(1.10–1.-7M)。该值几乎与乙酰胆碱的-logEC50值相同(表1)，后者显示浓度为0.0-7M(0.75-1.-7M)。
5.木炭粉胃肠道转运的评估为了评估RJ给药是否增加正常条件下木炭粉的胃肠道转运，对正常小鼠口服mg/kgRJ。RJ给药15min没有增加木炭粉行进的距离(图5，左)。此外，我们使用洛哌丁胺诱导的便秘模型评估了便秘条件下口服RJ的效果。口服10mg/kg洛哌丁胺可降低小鼠体内木炭粉的胃肠道转运，这与以前的报告一致。口服mg/kgRJ达15min不会影响洛哌丁胺诱导的便秘小鼠的木炭粉胃肠转运(图5)。
图5.口服RJ(mg/kg)对使用或不使用洛哌丁胺(10mg/kg)的小鼠的木炭粉胃肠转运的影响。口服洛哌丁胺或赋形剂30min，之后口服RJ或赋形剂15min。最后，口服木炭粉(10%木炭/10%阿拉伯树胶)30min，之后处死小鼠以评估胃肠传输。数值是平均值±SEM。*P0.05(通过邦费罗尼多重比较试验进行单向方差分析)。GI：肠胃。结论
RJ有时被推荐作为商业基础上的泻药，但这项研究的结果并不支持这一说法。我们的发现可能表明，在正常情况下，RJ可以单剂量给药，而不会引起胃肠道副作用，如腹泻。蜂蜜是由蜜蜂产生的，传统上也被用作治疗便秘的温和泻药。这种作用的机制被认为是果糖吸收不完全，这与健康个体的腹部症状和/或腹泻有关。此外，当健康成人摄入普通剂量的蜂蜜时，他们经常报告因碳水化合物吸收不良而引起的腹部不适。RJ不含高浓度的果糖和碳水化合物(果糖，蜂蜜含~35%，RJ含10%；碳水化合物，蜂蜜中~75%，RJ15%)。这些发现可以解释蜂蜜和RJ之间的效果差异。总之，在体外条件下，RJ乙酰胆碱通过*蕈碱乙酰胆碱受体引起小鼠回肠平滑肌收缩，这与烟碱乙酰胆碱受体活性无关。尽管RJ含有高浓度的乙酰胆碱，但单次口服RJ不足以增加肠蠕动或改善便秘。这些发现表明，在正常情况下，RJ不会引起严重症状，如腹泻。扫描